細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法常見問題與探討

摘要:

目的 總結(jié)歸納細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的常見問題。

方法 收集整理工作中發(fā)現(xiàn)的問題，查閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)資料，對(duì)照分析應(yīng)用情況并比較其差異。

結(jié)果與結(jié)論：從五個(gè)方面較為全面的總結(jié)了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所涉及到的問題，認(rèn)為在應(yīng)用方面還需要進(jìn)一步完善、規(guī)范。

[關(guān)鍵詞：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法；問題]

Discussion of common issues in the Bactaril Endutoxin Test, BET

ZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination, Wuhan 430064）

ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTS and CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.

Key word: Bactaril Endutoxin Test； problems

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(Bactaril Endutoxin Test,BET )是近二十年來發(fā)展起來的用于檢測(cè)藥品及其中間品中內(nèi)毒素污染的一種方法；作為家兔熱原檢查法的一種替代，已經(jīng)十分成熟，美國(guó)藥典迄今已為八百余種藥品制定了該項(xiàng)檢查法，中國(guó)藥典自1990年版開始收載以來，每版藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查品種也逐步增多，2005年版已增加到204種，并且在增補(bǔ)本中將繼續(xù)增加收載數(shù)量，該方法相對(duì)家兔熱原檢查法而言，有勞動(dòng)強(qiáng)度低、快捷、經(jīng)濟(jì)、靈敏和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，受到廣大藥品質(zhì)檢人員高度關(guān)注。2005年版藥典在2000年版藥典基礎(chǔ)上在方法學(xué)、結(jié)構(gòu)及細(xì)節(jié)上均進(jìn)行了重大修訂，使其更加規(guī)范、合理。

由于該方法本身是一復(fù)雜的酶促反應(yīng)過程，試驗(yàn)步驟比較多，每個(gè)品種的限值制定和試驗(yàn)過程中涉及到的標(biāo)準(zhǔn)品、鱟試劑、檢查用水及干擾因素等，均會(huì)給對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成不同程度的影響，以下是筆者近年來在藥品檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的較為常見的問題進(jìn)行的匯總, 以期對(duì)實(shí)際工作具有參考價(jià)值。

1、標(biāo)準(zhǔn)及限值的制定

一個(gè)品種的標(biāo)準(zhǔn)及限值制定的妥當(dāng)與否，直接決定了對(duì)藥品本身質(zhì)量的評(píng)價(jià)要求，標(biāo)準(zhǔn)要求太高、限值過嚴(yán)，往往影響產(chǎn)品的合格率，太松則不能保證藥品質(zhì)量，危及臨床用藥安全。為此，各國(guó)藥典均提出了基本的制定原則，除特殊情況需要說明外，一般注射劑均按人最大致熱閾值和人臨床每小時(shí)每公斤體重最大使用劑量的關(guān)系來確定，即L=K/M（通常靜脈給藥的K值為5Eu/kg，M為人每小時(shí)每公斤體重最大使用劑量），而大輸液(100-500ml) 的限值各國(guó)基本是一致的，無(wú)論是復(fù)方還是單方，均可按單位體積中所含內(nèi)毒素的量來控制，（一般按 0.5Eu/ml）；看似簡(jiǎn)單的問題，在執(zhí)行中卻經(jīng)常出現(xiàn)各種各樣的問題。常見問題舉例如下：

1．1 應(yīng)以重量(mg)表示的錯(cuò)用體積(ml)表示

注射用更昔洛韋鈉，按公式計(jì)算，其限值應(yīng)為1.0 Eu/mg，但生產(chǎn)單位要求改為0.5Eu/ml，且未提供任何制定理由，也未說明稀釋方法。使檢驗(yàn)人員無(wú)法操作。

1．2 不按人臨床用量計(jì)算，按熱原劑量計(jì)算

精氨酸阿斯匹林，若按人臨床用量計(jì)算其限值應(yīng)為0.3Eu/mg，但檢查法制定中卻按熱原劑量計(jì)算為0.03Eu/mg，嚴(yán)格了10倍，因濃度較高，出現(xiàn)了干擾，給試驗(yàn)帶來了麻煩。

1．3 隨意放寬標(biāo)準(zhǔn)

有的新藥研發(fā)單位對(duì)自己的產(chǎn)品沒有信心，或按規(guī)定的限值不能過關(guān)（檢驗(yàn)不合格或有干擾），則將標(biāo)準(zhǔn)隨意放寬，如0.5Eu/ml，研發(fā)單位自行改為“稀釋6倍后，按0.5Eu/ml。。。。。?！?，放寬了6倍，且未說明理由。

1．4 照搬錯(cuò)誤的標(biāo)準(zhǔn)

一品種限值根據(jù)其臨床用量計(jì)算應(yīng)為5Eu/mg，但已有暫行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，限值為75Eu/mg，廠家則要求改為75Eu/mg，實(shí)際上第一個(gè)廠家所報(bào)標(biāo)準(zhǔn)沒有根據(jù)，但由于漏審或未經(jīng)專業(yè)人員審查直接變成了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，此類標(biāo)準(zhǔn)太松。無(wú)法控制質(zhì)量。

1．5 相同品種具有不同的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

在2004年全國(guó)大輸液抽樣檢驗(yàn)的500批樣品中，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查和熱原檢查標(biāo)準(zhǔn)較為混亂，有的采用家兔熱原檢查法，有的則是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，且部分內(nèi)毒素檢查法同一品種限值卻不一樣。例如：克林霉素磷酸酯注射液，有的標(biāo)準(zhǔn)限值規(guī)定為0.5 Eu/mg，有的則為0.6 Eu/mg 。

1．6 隨意修改，將正確的改為不正確

某一注射用藥品，某省所在進(jìn)行方法學(xué)研究時(shí)，按臨床用量計(jì)算后將限值定為60Eu /mg；申報(bào)單位在資料匯總時(shí)改為：“取本品，加水5ml，再稀釋8倍，每瓶含內(nèi)毒素的量不得過100 Eu”。（本品規(guī)格為：10mg/支，人用量5mg/次）。盡管修改后的標(biāo)準(zhǔn)較之修改前嚴(yán)格了，但對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的修改沒有提供任何支持的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。此外，該標(biāo)準(zhǔn)尚存在三處明顯的錯(cuò)誤，其一是沒有注明細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，而是僅僅描述為加水。其二是沒有規(guī)定具體的藥品規(guī)格，只是描述為“每瓶含”，忽視了每瓶可能帶來的規(guī)格問題。其三則是限度的規(guī)定盡可能不使用類似“不得過”的描述，目前更準(zhǔn)確的描述多采用“應(yīng)小于.....”

1．7 檢驗(yàn)方法表述不清楚

紫杉醇注射液：“取本品，加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水至少稀釋40倍后，依法檢查（附錄2000年版 ⅪE），每ml中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于2.4Eu”；此類表述很容易引起理解上的錯(cuò)誤，是原液中的限值為2.4Eu /ml，還是稀釋后每ml中應(yīng)小于2.4Eu？無(wú)經(jīng)驗(yàn)的操作人員往往會(huì)認(rèn)為是后者。此類問題，2002年全國(guó)藥理室主任會(huì)及05年版內(nèi)毒素品種擴(kuò)大會(huì)議已有統(tǒng)一意見，不提倡如此寫法，因不同廠家、不同工藝生產(chǎn)的同一品種樣品往往干擾程度不一致，稀釋倍數(shù)就不一定相同（特別是中草藥注射劑）。

1．8 在藥典標(biāo)準(zhǔn)中出現(xiàn)原料藥與制劑限值不一致

阿米卡星（制劑）0.33Eu/mg，原料2.2Eu/mg，前者是計(jì)算值，后者如何得來，不得而知。（已將后者勘誤糾正為0.33 Eu/mg）

1．9 用滅菌注射用水代替細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

某質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)記述為：“取本品，加滅菌注射用水10ml溶解后，依法檢查．．．．．．”。此類標(biāo)準(zhǔn)往往是按說明書上臨床用法照搬而來的。

2、檢查方法及干擾試驗(yàn)

2．1樣品檢查

在對(duì)樣品進(jìn)行檢查時(shí)，由于研發(fā)單位對(duì)檢驗(yàn)人員的專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)不夠，使得操作者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)及操作中的基本概念區(qū)分不清，理解有誤。例如：

2．1．1 0.5ml/支裝量與靈敏度0.5Eu /ml的鱟試劑， 0.5Eu/ml與0.5EU/mg限值的概念不清。

2．1. 2 配制樣品溶液時(shí)，在理解限值（L）與鱟試劑靈敏度 ( λ ) 的關(guān)系問題上概念模糊，如：青霉素限值為0.01Eu/100u；有的用戶就認(rèn)為一定要0.01Eu/ml靈敏度的鱟試劑；又如甲硝唑注射液，過去的標(biāo)準(zhǔn)限值0.35Eu/ml，就要求買0.35Eu/ml靈敏度的鱟試劑。

2．1. 3 不管品種性質(zhì)是否適合將家兔熱原檢查法改為內(nèi)毒素檢查法，從而導(dǎo)致了標(biāo)準(zhǔn)上的不統(tǒng)一和結(jié)果的不一致。如：中草藥注射劑，一些新生物制品，某些醫(yī)療器材等，它們?cè)斐傻陌l(fā)熱可能不僅僅是內(nèi)毒素，可能還有多糖核苷酸，高分子抗原或半抗原等非內(nèi)毒素?zé)嵩?xì)菌內(nèi)毒素檢查不能檢測(cè)出該類物質(zhì)，一味地將這類產(chǎn)品改為BET，在臨床上可能就存在熱原反應(yīng)的隱患

2．2 干擾試驗(yàn)

在對(duì)某一品種建立細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的過程中，干擾實(shí)驗(yàn)是十分重要的環(huán)節(jié)，只有證實(shí)該品種不存在干擾或去除了干擾，才能用于日常的檢驗(yàn)。干擾的類型主要表現(xiàn)為抑制干擾和增強(qiáng)干擾。很多實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)表明絕大部分的干擾因素來自于樣品，如：不同來源的原料、生產(chǎn)工藝的改變，導(dǎo)致樣品的PH、樣品的成分、樣品的濃度等變化。因此，即使來自不同廠家的同一品種，其生產(chǎn)質(zhì)量也不盡相同，所以應(yīng)該要求每個(gè)生產(chǎn)廠家在報(bào)批時(shí)均應(yīng)提供有關(guān)方法學(xué)的研究報(bào)告。

表現(xiàn)在方法學(xué)驗(yàn)證及樣品最大無(wú)干擾濃度上的問題主要有：

2．2. 1 認(rèn)為國(guó)內(nèi)或國(guó)外已有生產(chǎn)的品種，方法學(xué)驗(yàn)證就可以不做。造成大量的新藥標(biāo)準(zhǔn)－特別是仿制藥未做系統(tǒng)的干擾試驗(yàn)。

2．2 . 2 認(rèn)為一定要按最大有效稀釋倍數(shù)（Maximum valid dilution MVD）或最小有效濃度（Minimum valid concentration MVC）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)，這種情況下，只要樣品內(nèi)毒素含量合格，可以在MVD范圍之內(nèi)，即小于MVD的倍數(shù)下進(jìn)行試驗(yàn)，如果一個(gè)樣品在小于MVD的情況下試驗(yàn)時(shí)樣品陽(yáng)性管有干擾，或樣品管為陽(yáng)性，可再按MVD進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的稀釋重新試驗(yàn).

3、與國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)的差異

3．1.單次試驗(yàn)鱟試劑的加樣

鱟試劑的規(guī)格分單次試驗(yàn)瓶（STV）及多次試驗(yàn)瓶(MTV)兩類。目前世界上除中國(guó)外其它國(guó)家STV的使用都是直接加0.2ml樣品溶液復(fù)溶試劑兼檢查。中國(guó)藥典對(duì)STV要求是先加0.1ml BET水復(fù)溶，再加0.1樣品溶液作檢查。

3．2.工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)標(biāo)定

內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(CSE)的效價(jià)標(biāo)定有兩種方法，一種是浮動(dòng)效價(jià)標(biāo)示法，另一種是固定效價(jià)標(biāo)示法。浮動(dòng)效價(jià)標(biāo)示法對(duì)每批號(hào)CSE只標(biāo)示它的含量（重量，如mg, ng等），當(dāng)這批號(hào)CSE確定配那一批鱟試劑使用時(shí)，鱟試劑廠家才向用戶提供一份效價(jià)測(cè)定證書(Certificate of Analysis, CoA)，給出使用該批號(hào)鱟試劑測(cè)定的RSE/CSE比率以及該批號(hào)CSE的效價(jià)。固定效價(jià)標(biāo)示法是以某一批（或數(shù)批）鱟試劑測(cè)定該批CSE的RSE/CSE比率，從而計(jì)算出該批CSE的效價(jià)。例如，某批鱟試劑對(duì)某批CSE的RSE／CSE比率是8Eu/ng，該批CSE的裝量是10 ng/支，則CSE的效價(jià)就是8Eu/ng×10ng/支＝80Eu/支，以此作為該批CSE的標(biāo)示效價(jià)。目前歐美國(guó)家采用的是浮動(dòng)效價(jià)標(biāo)示法，我國(guó)采用的是固定效價(jià)標(biāo)示法。以上兩種效價(jià)標(biāo)示方法都有所長(zhǎng)和不足，其應(yīng)用背景也不盡相同。

嚴(yán)格說來，中國(guó)的工作標(biāo)準(zhǔn)品和美國(guó)的工作標(biāo)準(zhǔn)品在定義上不完全一致，中國(guó)藥典對(duì)內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的定義是：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于實(shí)驗(yàn)中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾實(shí)驗(yàn)和設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。美國(guó)內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品最初的使用是源于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的費(fèi)用較高和對(duì)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的潛在消耗，建立工作品的主要目的是作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的替代品，用于日常內(nèi)毒素檢測(cè)工作的，由于美國(guó)實(shí)行鱟試劑批批檢制度，因此工作品不用于鱟試劑靈敏度的復(fù)核，主要是用于設(shè)置各種陽(yáng)性對(duì)照（陽(yáng)性對(duì)照和供試品陽(yáng)性對(duì)照）和確證試劑、實(shí)驗(yàn)材料和操作方法的可行性；FDA對(duì)工作品不進(jìn)行控制，由生產(chǎn)廠家自行生產(chǎn)和管理。

在我國(guó)，現(xiàn)階段對(duì)鱟試劑的靈敏度沒有進(jìn)行批批檢定，鱟試劑的出廠檢驗(yàn)一直是由廠家自行按部頒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行；由于各鱟試劑廠家之間的生產(chǎn)條件、工藝技術(shù)水平還存在一定差異，很難保證每一批鱟試劑的靈敏度都符合標(biāo)準(zhǔn)，為此規(guī)定用戶在使用前用統(tǒng)一的工作品復(fù)核靈敏度；應(yīng)該說，中國(guó)的工作標(biāo)準(zhǔn)品除了有“工作”的含義外，還有一定意義上的“監(jiān)控”作用?；诖?，就現(xiàn)階段來說，我們還無(wú)法評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)外這種標(biāo)定差異上的利與弊，期望今后能在不斷的實(shí)踐過程中，能找出更為有效的、合理的辦法。

3.3 對(duì)供試品溶液pH要求

中國(guó)藥典BET法對(duì)供試品溶液的pH值要求在6.0~8.0的范圍內(nèi)。但實(shí)際上，有許多樣品溶液的pH值不在此范圍內(nèi)也對(duì)BET不造成干擾，原因是鱟試劑本身有緩沖能力。事實(shí)上，應(yīng)該這樣認(rèn)為：一個(gè)供試品是否要調(diào)節(jié)pH值，應(yīng)根據(jù)干擾試驗(yàn)的結(jié)果來判斷。如果該供試品對(duì)BET有干擾，且干擾的原因是由pH值不適宜造成的，才有必要調(diào)節(jié)供試品的pH值。美國(guó)藥典BET法對(duì)供試品溶液pH的要求是：測(cè)定供試品溶液與鱟試劑溶液的等體積混合液的pH值，應(yīng)在6.0~8.0范圍內(nèi)。這意味著當(dāng)供試品溶液的pH值的影響超出了鱟試劑的緩沖能力時(shí)，才需要去調(diào)節(jié)供試品的pH。

4、關(guān)于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水

2005版藥典規(guī)定凝膠法用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.015Eu/ml ，對(duì)使用靈敏度為0.5Eu/ml的鱟試劑沒有多大問題，但如果用0.03Eu/ml的鱟試劑則可能存在問題。如果試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，則應(yīng)慎重考慮。

5 、其它

5、1不宜建立BET的品種

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn) ：

5.1.1中草藥注射劑，由于中藥成份復(fù)雜、干擾因素多、同一品種樣品往往干擾程度不一致，且陽(yáng)性率偏高；如炎琥寧，復(fù)方丹參注射液、紅花注射液、紫杉醇注射液等。

5.1.2部分生物制劑及鈣鎂離子鰲合劑，酶抑制劑等

5.2需要處理的品種

5.2.1 不適宜的pH條件，如樣品的 pH值偏高或偏低，可用堿性或酸性緩沖液來調(diào)節(jié)至合適的pH值范圍，或采用高靈敏度鱟試劑進(jìn)行相應(yīng)稀釋后來解決。濃度較高的氨基酸品種及部分抗生素品種均可通過通過以上方法來解決干擾。

5.2.2 由于鱟試劑中促使凝膠形成的絲氨酸蛋白酶可以被多種化學(xué)物質(zhì)變性失活（如醇、酚、抗癌藥物等），如果導(dǎo)致鱟試劑變化的藥物是蛋白酶類，可用70℃加熱10分鐘左右熱處理后再稀釋，或者使用超過濾的方法。

5.2.3 對(duì)鈣鎂離子有鰲合作用的品種，可使用含鈣鎂離子的溶液來稀釋樣品。

以上方式均需進(jìn)行方法驗(yàn)證，以證明對(duì)添加內(nèi)毒素回收不存在抑制或增強(qiáng)，可以通過與水中對(duì)照內(nèi)毒素的回收進(jìn)行比較得以驗(yàn)證。

5.3 建立BET 應(yīng)注意的事項(xiàng)

5.3. 1 大輸液品種限值一般定為0.5Eu/ml., 小劑量注射劑及凍干劑限值按人臨床用每小時(shí)每公斤體重最大給藥劑量計(jì)算，同時(shí)應(yīng)考慮聯(lián)合用藥及給藥途徑，推注、靜注應(yīng)從嚴(yán)把握，必要時(shí)，對(duì)L值應(yīng)作相應(yīng)調(diào)整。單純的肌肉給藥且用量不大的品種可以不建立BET。

5.3.2 限值單位表述方法應(yīng)正確、規(guī)范；注射用、凍干劑一般以主藥含量計(jì)算，以Eu/mg表示；不宜用Eu/每瓶表示。小劑量注射液用Eu/mg或Eu/ml均可；大劑量注射液一般用Eu/ml表示。

5.3. 3 所有稀釋用水均應(yīng)為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，因?yàn)樽⑸溆盟推渌ルx子水中內(nèi)毒素及其它因素控制要求較低，會(huì)影響細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。

5.3.4標(biāo)準(zhǔn)的制定應(yīng)有依據(jù)，應(yīng)有起草說明. 不僅僅新藥，仿制藥也應(yīng)做方法學(xué)研究；因?yàn)椴煌墓に嚿a(chǎn)的樣品往往質(zhì)量不一樣；建議使用三批不同時(shí)間生產(chǎn)的樣品，用2個(gè)以上廠家生產(chǎn)的鱟試劑進(jìn)行方法學(xué)研究、以考察制劑工藝的穩(wěn)定性。